رديابي همزمان پكتوباكتريوم هاي سيب زميني سازگار با شرايط گرم به روش Multiplex-PCR

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

گياهپزشكي

كارشناسي ارشد

چكيده بيماري ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب زميني از مهم ترين بيماري هاي سيب زميني محسوب مي شوند كه در مزرعه و مراحل پس از برداشت، خسارت قابل توجهي به اين محصول وارد مي كنند. اين بيماري ها توسط گونه هايي از دو جنس باكتريايي Pectobacterium و Dickeya ايجاد مي شوند كه در سال هاي اخير و به دليل افزايش دماي اقليمي، گونه هاي گرمادوست P. parmentieri (Pp)، P. brasiliense (Pbr) و (Dsol) D.solani انتشار بيشتري در مزارع جهان و نيز ايران پيدا كرده اند. به دليل يكسان بودن فرايند توليد غده هاي خوراكي و بذري سيب زميني درايران، احتمال آن وجود دارد كه اين عوامل بيمارگر باكتريايي از مناطق آلوده به ساير نواحي كشت سيب زميني نيز منتقل شوند. بنابراين، كسب اطمينان از عدم آلودگي غده هاي بذري سيب زميني به اين باكتري هاي بيمارگر، براي براي كاهش شيوع بيماري هاي ساق سياه و پوسيدگي نرم در كشور لازم است. به اين لحاظ، دستيابي به يك روش كار آمد و ساده براي رديابي سريع Pp، Pbr و Dsol در غده هاي بذري سيب زميني، به عنوان هدف اصلي اين پژوهش در نظر گرفته شد . به اين منظور، ابتدا دو جدايه P7 و P60 از Pp، L4 و P63 از Pbr و نيز Dh12 و D2222 از Dsol براي انجام آزمايشات اوليه انتخاب شدند. هيچكدام از اين جدايه ها در ℃5 توانايي ايجاد پوسيدگي نرم در برشهاي غده سيب زميني را نداشتند، ولي علايم بيماري در ℃28 براي تمام جدايه ها شديد بود. پيشرفت لهيدگي جدايه هاي Dsol در دماي ℃35 نسبت به جدايه هاي Pp وPbr بيشتر ارزيابي شد. پس از به كارگيري روش هاي استاندارد باكتري شناسي و اطمينان از همساني ويژگي هاي مورفوژيكي، بيماري زايي، فيزيولوژيكي و بيوشيميايي جدايه هاي هرگونه، سه جدايه P60 از Pp، L4 از Pbr و نيز Dh12 از Dsol براي انجام آزمون هاي رديابي مولكولي باكتري به روش Multiplex-PCR انتخاب شدند. پس از استخراج DNA از جدايه ها به دو روش CTAB و جوشانيدن ، ابتدا تكثير باند مورد نظر DNA اين باكتري ها به ترتيب با جفت آغازگرهاي اختصاصي Pw7011F/R براي Pp (bp 140)، BR1F/R براي Pbr (bp 322) و DSF1/DSR2 (bp 895) تاييد شد. در مراحل بعد و طي آزمون هاي مكرر، با استفاده از روش رقيق كردن متوالي DNA جدايه ها و جفت آغازگرهاي اختصاصي و نيز تغيير دماي اتصال آغازگرها در آزمون هاي Gradient-PCR ، غلظت بهينه DNA، غلظت جفت آغازگرها و دماي اتصال واكنش براي انجام آزمون هاي Duplex-PCR و Multiplex-PCR بررسي گرديد. بر اساس نتايج بدست آمده، غلظت 40ng/µl از DNA هر باكتري، به كارگيري غلظت pmol 10 از هر آغازگر، افزودن 25mM از Mg Cl2 به عنوان مقادير بهينه هر مخلوط واكنش 20 ميكروليتري و استفاده از دماي اتصال 62℃ و دماي گسترش 65℃ در انجام هر واكنش ، براي تكثير قطعات DNA مورد انتظار آزمون هاي PCR، Duplex PCR و Triplex PCR تعيين شد. در تعيين كارآيي آزمون هاي سه گانه PCR براي رديابي باكتري هاي Pp، Pbr و Dsol از غده هاي آلوده، ابتدا، سوسپانسيوني از هر جدايه به صورت انفرادي، مخلوط دوتايي و مخلوط سه تايي در غده هاي جداگانه مايه زني شدند. پس از بروز لهيدگي در بافت غده ها، يك گرم از بافت لهيده هر تيمار براي استخراج DNA بكار رفت و سپس واكنش هاي PCR، Duplex PCR و Triplex PCR براي هر تيمار انجام گرفت. نتايج نشان داد كه روش هاي بهينه سازي شده Multiplex PCR مي تواند بصورت دقيق و با با كيفيتي مناسب باكتري هاي هدف را در غده هاي آلوده شناسايي كند. در مجموع، مي توان گفت امكان رديابي منفرد و يا همزمان سه جدايه Pp، Pbr و Dsol از غده هاي سيب زميني با روش بهينه سازي شده Multiplex-PCR در اين پژوهش موفقيت آميز بود. بنظر مي رسد روش هاي Multiplex-PCR توسعه يافته در اين پژوهش براي غربالگري غده ها ي سيب زميني از نظر آلودگي به باكتريهاي Pp، Pbr و Dsol به لحاظ اهداف قرنطينه اي و نيز صدور گواهي سلامت بذر مفيد واقع شود.

238011

بيماري شناسي گياهي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان