شناسايي پكتوباكتريوم هاي عامل بيماري ساق سياه سيب زميني در استان اصفهان و توسعه زيست حسگر الكتروشيميايي براي رديابي باكتري قرنطينه اي Pectobacterium atrosepticum

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

كشاورزي

دكتري

بيماري¬هاي ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب زميني از جمله بيماري¬هاي باكتريايي مهمي هستند كه با انتشار جهاني خسارت اقتصادي زيادي به توليد سيب¬زميني وارد مي¬كنند. گونه و زير گونه¬هاي مختلفي از دو جنس Pectobacterium spp. و Dickeya spp. متعلق به Enterobacteriaceae مي¬توانند در بروز اين بيماري دخيل باشند. طي ساليان طولاني(Pba) P.atrosepticum و(Pcc) P.carotovorum subsp. carotovorum به عنوان عوامل اصلي بروز ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب¬زميني شناخته مي¬شدند، ولي پيدايش و حضور باكتري هاي (Dch) D.chrysanthemi، D.solani، P. carotovorum subsp. brasiliense (Pcb) و (Pp) P.parmentieri طي سال¬هاي اخير در مزارع سيب¬زميني دنيا كه احتمالا به دليل افزايش گرمايش زمين و قدرت نوتركيبي زياد پكتوباكتريوم¬ها است، نشان داد كه گونه و زيرگونه-هاي ديگري از پكتوباكتريوم¬ها مي¬توانند در وقوع ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب¬زميني دخالت داشته باشند. از سال¬ها قبل، در ايران نيز Pba به طور محدود و Pcc در حد گسترده¬اي به عنوان دو عامل اصلي ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب¬زميني شناخته شده¬ بودند، ولي با گزارش Dch ، D.solani و Pp از مزارع سيب زميني اصفهان، كه احتمالا ازطريق واردات غده¬هاي بذري از اروپا به كشور وارد شده اند و با شرايط گرم فصل رشد سيب¬زميني در اصفهان سازگاري داشتند، پيش بيني شد كه احتمالا ساير گونه¬ها و زيرگونه¬هاي پكتوباكتريومي نيز ممكن است در مزارع اصفهان انتشار داشته باشند. براي تعيين وضعيت انتشار پكتوباكتريوم¬ها در منطقه ، طي ماه¬هاي خرداد تا مهر سال¬هاي1397-1394 از نواحي سيب¬زميني كاري استان اصفهان بازديد¬هايي به¬عمل آمد و از ساقه، ريشه و غده¬هاي داراي علائم ساق سياه و پوسيدگي نرم نمونه-برداري شد. پس از جداسازي باكتري از بافت¬هاي گياهي آلوده، با استفاده از آزمون¬هاي مورفولوژيكي، فيزيولوژيكي و بيوشيميايي، جدايه-هاي متعلق به گروه¬هاي پكتوباكتريومي مشخص شدند. بر اساس انگشت نگاري ژنتيكي با استفاده از جفت آغازگر ¬هاي BOXIR وERIC1R/ ERIC2F، جدايه¬ها در چهار گروه طبقه بندي شدند. سپس، طي آزمايشات PCR با جفت آغازگر¬هاي اختصاصي و تعيين توالي نوكلئوتيدي محصولات PCR، مشخص شد كه از 202 نمونه¬ي باكتريايي به¬دست آمده در اين پژوهش، 4 جدايه Pba ، 12 جدايه Pcb، 76 جدايه Pcc و 110 جدايه Pp هستند، ولي هيچكدام متعلق به جنس Dickeya نبودند. تعداد كم جدايه ¬هاي باكتري Pba از منطقه سردسير استان اصفهان (چادگان) و همچنين شيوع Pcb، Pcc و Pp به عنوان عوامل ساق سياه و پوسيدگي نرم سيب¬زميني در مناطق معتدل و گرم اصفهان دور از انتظار نبود. به دليل عدم وجود يك جفت آغازگر اختصاصي براي شناسايي Pp براي غربال گري مزارع و غده هاي بذري، بر اساس مقايسه توالي كل ژنوم گونه¬هاي مختلف Pectobacterium spp. و Dickeya spp. ثبت شده در بانك جهاني ژن، يك ناحيه¬ي نوكلئوتيدي منحصر به¬فرد بين ژني bp 3036 در جدايه WPP161 Pp شناسايي و بر اساس آن، يك جفت آغازگر اختصاصي از اين ناحيه بين ژني طراحي شد. با بكارگيري يك سري از آزمون¬هاي PCR و تعيين توالي نوكلئوتيدي، اختصاصيت و حساسيت اين جفت آغازگر براي تشخيص انتخابي جدايه¬هاي Pp تاييد گرديد. با انجام آزمون بيماري¬زايي جدايه¬هاي شاخص هر گروه در شرايط آزمايشگاهي و گلخانه¬اي، بيماري¬زا بودن جدايه¬ها ثابت گرديد. همچنين، طي آزمون لهيدگي روي برش¬هاي سيب¬زميني معلوم شد كه جدايه هاي شاخص از نظر فعاليت هاي پكتوليتيكي تحت دماهاي مختلف °C 4،°C 10،°C 20، °C 27 و°C 37 با هم تفاوت دارند. با توجه به رديابي گونه Pba به عنوان يك بيمارگر قرنطينه اي در اين پژوهش، از روش LAMP جهت رديابي سريع آن استفاده شد. بر اساس نتايج بدست آمده، اين روش براي شناسايي باكتري Pba در حد Cfu/ml 102 قابل اعتماد بود. در مقابل، تهيه آنتي بادي پلي كلونال عليه Pba و استخراج گاماگلوبولين استخراج شده (IgG) طي آزمون ELISA غير مستقيم براي تشخيص اختصاصي Pba به دليل واكنش هاي تقاطعي با ساير پكتوباكتريوم ها، موفقيت آميز نبود. براي توسعه يك روش تشخيصي دقيق، حساس و مقرون به صرفه براي رديابي Pba، يك زيست حسگر مبتني بر آنتي بادي و طيف سنجي امپدانس الكتروشيميايي بر اساس فناوري آزمايشگاه روي تراشه (Lab-on-a-chip) ساخته شد. تثبيت آنتي بادي روي سطح الكترود با استفاده از لايه هاي خود آرا SAMs (Self-assembled monolayers) انجام گرفت. به اين روش، باكتري Pba بر اساس افزايش در مقاومت انتقال بار زيست حسگر به دليل بر همكنش آنتي¬بادي- آنتي ژن و اندازه گيري امپدانس الكتروشيميايي (EIS) با حساسيت Cfu/ml 104 ،بطور اختصاصي شناسايي شد.......

221223

بيماري شناسي گياهي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان