بيان دگرساخت ژن كد كننده آنزيم كاتالاز گياه حرا (Avicennia marina) در باكتري Escherichia coli

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

كشاورزي

كارشناسي ارشد

كاتالاز (CAT) يك آنزيم مهاركننده كليدي براي تجزيه هيدروژن پراكسيد (H2O2) است كه نقش مهمي در تحمل به تنش‌هاي غيرزيستي مختلف در بسياري از موجودات زنده دارد. كاتالازها در صنايع غذايي، پزشكي، دارويي، كاغذ، صنعت نساجي و همچنين زيست پالايي استفاده مي¬شود. گياه حرا (Avicennia marina ) سازگاري منحصر به فردي براي مقابله با شرايط تنش محيطي مانند شوري زياد، دماي بالا، موادغذايي كم و تشعشعات بيش از حد دارد و داراي مكانيسم¬هاي سلولي متفاوتي براي حفظ غلظت صحيح يون¬هاي فلزي ضروري در قسمت¬هاي مختلف سلولي مي¬باشدكه به سبب سيستم آنتي¬اكسيداني قوي در به حداقل رساندن آسيب ناشي از قرار گرفتن در معرض غلظت¬هاي سمي فلزات ضروري و غيرضروري نقش مهمي دارد. در اين مطالعه به منظور مشخصه¬يابي آنزيم كاتالاز در گياه حرا ژن كد كننده اين آنزيم در ‍پلاسميد pET32a همسانه¬سازي شد و سپس با انتقال به سويه Rosetta (DE3) نوتركيب R-AmCAT ايجاد و با القاي باكتري توسط ايزوپروپيل بتا-دي-1-تيوگالاكتوپيرانوزيد(IPTG) بيان پروتئين در باكتري القا شد. با تخريب سلول با استفاده از روش شوينده سديم دودسيل سولفات (SDS) و روش ليز آنزيمي پروتئين¬هاي كل و محلول باكتري به ترتيب استخراج شدند. فعايت آنزيمي كاتالاز نوتركيب Trx-AmCAT به روش مبتني بر اكسيداسيون يك الكل مانند متانول به فرمالدئيد در حضور هيدروژن پراكسيد سنجيده شد. همچنين در اين تحقيق، اثر غلظت¬هاي مختلف هيدروژن پراكسيد، نمك كلريد سديم، بوتانول، اتانول، سوربيتول، دما و فلزات سنگيني مانند كادميوم و سرب بر روند رشد سويه تراريخت AmCAT و تحمل اين سويه در برابر اين تنش¬ها مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه AmCAT به صورت فيوژن پروتئين Trx-AmCAT با مقدار بيشتر در فاز نامحلول و با مقدار كمتر در فاز محول توليد ¬شد و تغيير ميزان IPTG و كاهش دما تاثير زيادي بر روي افزايش حلاليت پروتئين ندارد. پروتئين استخراج شده از باكتري R-AmCAT فعاليت آنزيمي در حدود 89/14 واحد بر ميلي گرم بر اساس متد اكسيداسيون الكل و1200 واحد بر ميلي گرم بر اساس كاهش ميزان هيدروژن پراكسيد نشان داد. اين مقدار براي كاتالاز در سويه شاهد به ميزان دو برابر كاهش داشت. در مقايسه اين كاتالاز با كاتالاز كبد گاو به ميزان 5/3 برابر كمتر بود و در مقايسه با كاتالاز در ديگر گياهان از سطح فعاليت خوبي برخوردار بود. بيان دگرساخت AmCAT، نقش مهمي در تحمل باكتري به استرس غيرزيستي مانند هيدروژن پراكسيد، نمك كلريد سديم، بوتانول، اتانول، دما و فلز سرب دارد.

223707

بيوتكنولوژي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان