تشخيص ويروسSARS-CoV-2 در بيماران زير 45 سال با روش RT-qPCR و بررسي امكان تشخيص آن با روش RT-LAMP

كارشناسي ارشد

گسترش سريع ويروسSARS-CoV-2در سرتاسر دنياو بالا بودن سرعت انتقال آن، نياز هرچه بيشتر به گسترش روش‌هاي تشخيصي مختلف را به وجود آورده‌است.روش‌هاي تشخيصي مختلفي براي شناسايي افراد آلوده به ويروس مورد استفاده قرار مي‌گيرد. دسته‌اي از اين روش‌ها برپايه‌ي تكثير مولكولي يك يا چند ژن هدف از ويروس است. متداول‌ترين روش، RT-qPCRاست كه به عنوان يك روش استاندارد تشخيصي درنظر گرفته شده است.البته به دليل يكسري از معايب اين روش از جمله نياز به دستگاه ترموسايكلر، روش‌هاي مولكولي ديگري مثل تكثير هم‌دمانيز موردتوجه قرار گرفته‌اند كه رايج‌ترين آن‌ها، RT-LAMPاست. اين روش به كمك چهار تا شش پرايمر، ژن هدف را در يك دماي ثابت(برخلاف RT-qPCR) تكثير مي‌كند. در كنار اين روش‌ها، كيت‌هاي تشخيص سريع نيز براي شناسايي افراد آلوده به SARS-CoV-2 گسترش يافته‌است.اين كيت‌ها در حقيقت روش‌هاي ايمونولوژي و يا مولكولي مرسوم را با LFA تركيب كرده و مشاهده‌ي نتايج اين روش‌ها را ساده‌تر مي‌كنند. در اين پژوهش، ابتدا با كمك دو روش مولكولي RT-qPCR و RT-LAMPرنگ‌سنجي، تشخيص ويروس SARS-CoV-2 در 34 نمونه‌ي سواب بيني و حلق صورت گرفت. با روش RT-qPCR ژن RdRp و با روش RT-LAMP ژن ORF8 شناسايي شدند.براي تعدادي از نمونه‌ها، فرايند تشخيصي با RT-LAMP رنگ‌سنجي به صورت مستقيم؛ يعني بدون فرايند استخراج RNA انجام شد. سپس تست‌ نواريLFA برپايه‌ي نانوذرات طلا ساخته شده و با روشRT-LAMP تركيب شد. در اين روش، دو پرايمر از شش پرايمر ژن ORF8، با بيوتين و Dig نشاندار شدند. نانوذرات طلا با آنتي‌بادي Anti-Digكونژوگه شده و در نقاط كنترل و تست به ترتيب، آنتي‌بادي ضد Anti-Dig و استرپتاويدين بارگذاري شد. بدون نياز به فرايند استخراج RNA، واكنش RT-LAMP روي نمونه‌هاي سواب بيني و حلق انجام شد و سپس نتايج با دو روش ژل الكتروفورز و LFA مورد بررسي قرار گرفتند. براساس نتايج بدست آمده از مقايسه‌ي نتايج RT-qPCR و RT-LAMP رنگ‌سنجي، اين روش تكثير هم‌دما داراي حساسيت 96.67 درصدي و اختصاصيت 75 درصدي بودهو عملكرد قابل قبولي روي نمونه‌هاي بدون استخراج نشان داد. از طرف ديگر، روش RT-LAMP-LFA توانست به خوبي نمونه‌هاي مثبت و منفي را با حساسيت 100درصدي و اختصاصيت 77.27درصدي تشخيص دهد. در اين روش، تنها نمونه‌هاي سواب بيني و حلق به مدت 10 دقيقه در دماي ºC65 حرارت داده شدند و سپس در واكنش RT-LAMP استفاده شدند. درمجموع، اين روش تكثير هم‌دما در تركيب با روش تشخيص سريع LFA و بدون نياز به فرايند استخراج RNA، مي‌تواند به عنوان يك روش تشخيصي براي SARS-CoV-2 مورد استفاده قرار گيرد.

230339

دانشگاه اصفهان

معين دهباشي

زيست شناسي - ژنتيك مولكولي

زهره حجتي