رديابي همزمان باكتري هاي مهم بذرزاد لوبيا با استفاده از روش Multiplex-PCR

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيماري شناسي گياهي

كارشناسي ارشد

چكيده گياه لوبيا (.Phaseolus vulgaris L ) به عنوان يك منبع پروتئيني ، نقش مهمي در رژيم غذايي انسان دارد و به اين سبب كشت آن در همه كشور‌هاي جهان و ايران متداول است. در بين بيماري‌هاي معمول گياه لوبيا، سه بيماري باكتريايي رايج شامل سوختگي معمولي لوبيا، Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap)، پژمردگي باكتريايي لوبيا Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) و سوختگي هاله‌اي لوبيا Pseudomonas savastonoi pv.phaseolicola (Psp) از مهم‌ترين بيماري‌هاي بذرزاد محسوب مي‌شوند كه در سال‌هاي اخير خسارت زيادي به مزارع لوبيا در ايران وارد كرده‌اند. به دليل يكسان بودن روند توليد و عرضه دانه‌هاي لوبياي مصرفي و بذري در ايران، امكان انتقال اين بيمارگرهاي باكتريايي از مناطق آلوده به ساير نواحي كشت لوبيا در كشور وجود دارد. بنابراين، كسب اطمينان از عدم آلودگي بذرهاي لوبياي مورد كاشت به اين باكتري‌هاي بيمارگر، درجهت مديريت سه بيماري سوختگي معمولي، پژمردگي و سوختگي هاله اي لوبيا ضروري است. به اين لحاظ، دستيابي به يك روش سريع، كم هزينه و آسان براي رديابي Xap، Cff و Psp در بذرهاي لوبيا، هدف اصلي اين پژوهش در نظرگرفته شد. به اين منظور، پس از تاييد مشخصات مورفوژيكي، بيماري‌زايي، فيزيولوژيكي و بيوشيميايي، سه جدايه منتخب Xap58، Cff19 و Psp26 متعلق به پاتووارهاي Xap، Cff و Psp براي انجام آزمون‌هاي رديابي مولكولي باكتري از بذر به روش PCR انتخاب شدند. در مرحله اول، ازتكثير قطعات مورد انتظار DNA اين باكتري‌ها به ترتيب با جفت آغازگرهاي اختصاصي X4c/X4e (bp 730)، Cff-for2/Cff-rev4 (bp 306) و P5.1/P3.1 (bp 502) اطمينان حاصل شد. در مراحل بعد، با استفاده از روش‌هاي رقيق كردن متوالي DNA باكتريايي و جفت آغازگرهاي اختصاصي، به همراه آزمون شيب حرارتي ، غلظت ng/µl 20 از DNA، غلظت pmol 10 آغازگر و دماي اتصال Cº 57 به عنوان مقادير بهينه هر واكنش 20 ميكروليتري، براي تكثير قطعات DNA مورد انتظار آزمون هاي PCR، duplex PCR و triplex PCR تعيين شد. با رقيق سازي متوالي سوسپانسيون cfu/ml 107جدايه هاي Xap58، Cff19 و Psp26 و سپس استخراج DNA از آنها به روش جوشانيدن و انجام آزمون‌هاي PCR معلوم شد كه هر سه جدايه در PCR انفرادي و همچنين duplex PCR با جفت آغازگرهاي اختصاصي خود تا رقت 10-3 و triplex PCR تا رقت 1-10 قابليت رديابي دارند. در تعيين حساسيت آزمون هاي سه گانه PCR براي رديابي باكتريها، ابتدا بذور لوبيا سفيد به روش غوطه ور سازي در سوسپانسيون‌هاي انفرادي، مخلوط دو به دو و سه تايي با جدايههاي Xap58، Cff19 و Psp26 آلوده شدند. پس از خشك كردن بذور در معرض هوا ، در فواصل زماني 0، 2، 4، 8، 16، 32، 64 و 128 روز ، دو بذر از هر تيمار در محيط Nutrient broth غوطه ور شدند و پس از نگهداري 18 ساعته روي شيكر با تكانش 150 دور در دقيقه در آزمايشگاه، DNA نمونهها از هر تيمار استخراج شد. نتايج واكنش‌هاي PCR با اين نمونهها نشان داد كه با هر سه روش انفرادي، duplex PCR و triplex PCR، امكان رديابي هر سه باكتري Xap58، Cff19 و Psp26 از روي بذر‌هاي لوبيا حداقل تا 128 روز وجود دارد. با بررسي جزئيات بيشتر براي بهينه كردن اين روش triplex PCR ، مي‌توان از اين روش براي تعيين آلودگي بذرهاي لوبيا استفاده نمود. كلمات كليدي: سوختگي معمولي لوبيا، پژمردگي باكتريايي لوبيا، سوختگي هاله‌اي لوبيا، ،duplex PCR، Triplex-PCR

232913

بيماري شناسي گياهي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان