بكارگيري روش Loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) براي شناسايي Tilletia controversa عامل سياهك پاكوتاه گندم در ايران

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيماري شناسي گياهي

كارشناسي ارشد

گندم (Triticum aestivum L.) به‌عنوان يكي از اعضاي خانواده گرامينه (Poaceae)، نقش مهمي در امنيت غذايي جهاني و تجارت بين‌المللي غلات دارد. از مهم‌ترين بيماري‌هاي بذرزاد گندم، بيماري‌هاي سياهك پنهان گندم، ناشي از گونه‌هاي Tilletia هستند. اين بيمارگر‌ها علاوه بر كاهش عملكرد و كيفيت محصول، تجارت بين‌المللي غلات را نيز به دليل مقررات سختگيرانه قرنطينه‌اي، محدود مي‌كنند. روش‌هاي تشخيصي متداول شامل شناسايي مورفولوژيك و روش‌هاي مبتني بر PCR، يا زمان‌بر بوده، يا نيازمند تخصص فني بالا هستند و يا براي كاربردهاي سريع و دقيق در مزرعه مناسب نمي‌باشند. در سال‌هاي اخير، تكثير هم‌دما به‌واسطه حلقه (LAMP) به‌عنوان روشي سريع، حساس و سازگار با شرايط ميداني براي شناسايي بيمارگرهاي گياهي مطرح شده است. اين مطالعه با هدف به‌كارگيري LAMP براي شناسايي سريع و دقيق عوامل سياهك پنهان گندم در ايران، به‌ويژه T. controversa، انجام شد. توان تشخيصي اين آزمون با استفاده از نمونه‌هاي قارچي متعدد، ارزيابي و با روش‌هاي مرسوم PCR مقايسه گرديد. هشت گونه از قارچ‌هاي مولد سياهك از جمله چهار گونه مختلف جنس Tilletia در اين پژوهش مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج DNA با استفاده از چهار روش متداول شامل موري و تامسون، ريدر و برودا، كلكس100 و هات‌شات انجام گرفت. هرچند باندهاي DNA پس از استخراج به‌طور مستقيم روي ژل آگارز قابل مشاهده نبودند، اما PCR با آغازگرهاي عمومي قارچي (ITS1/ITS4) حضور و كيفيت DNA را تأييد نمود. همچنين، PCR با آغازگرهاي خارجي LAMP (F3/B3)، وجود ناحيه هدف و اختصاصيت آغازگرها را نشان داد. واكنش‌هاي LAMP با استفاده از مجموعه آغازگرهايي كه پيش‌تر توسط صداقت‌جو و همكاران (2021) طراحي شده بودند، انجام شد. رنگ Neutral red به‌عنوان شناساگر استفاده گرديد و نتايج با الكتروفورز ژل آگارز تأييد شدند. هر چهار روش استخراج، DNA الگوي با كيفيت و كميت كافي براي استفاده در PCR و LAMP فراهم كردند. آزمون LAMP به‌طور اختصاصي T. controversa را شناسايي نمود، به‌طوري كه واكنش‌هاي حاوي ژنوم آن، همواره مثبت بوده و تغيير رنگ واضحي از نارنجي به صورتي نشان دادند. همچنين الگوي نردباني كه مشخصه تكثير با روش LAMP است، روي ژل آگارز نشان داده شد. كنترل‌هاي منفي شامل ساير قارچ‌هاي مولد سياهك و كنترل فاقد DNA الگو هيچ تكثير و تغيير رنگي نشان ندادند. آزمونLAMP توسعه‌يافته براي شناسايي T. controversa، به‌عنوان روشي سريع، اختصاصي و حساس ثابت شد. اين روش بسياري از محدوديت‌هاي روش‌هاي متداول را برطرف مي‌سازد. دقت بالاي اين روش، همراه با امكان مشاهده‌ي نتايج در لحظه، آن را براي كاربرد در بازرسي‌هاي قرنطينه‌اي و مراكز گواهي بذر در ايران مناسب مي‌سازد. اين مطالعه ظرفيت آزمون LAMP را به‌عنوان روشي كاربردي براي تشخيص سياهك كوتوله گندم نشان داده و زمينه را براي ادغام آن در برنامه‌هاي بهداشت گياهي فراهم مي‌نمايد.

235231

ندارد

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان